Хотя автоматические секвенаторы ДНК позволяют считывать намного дольше, чем ручные методы, длина последовательности, которую можно получить за один прогон, все еще ограничена. Например, в большинстве систем секвенирования всю последовательность фрагментов ДНК длиной более 500 п.н. обычно невозможно получить за один прогон, и поэтому, если мы хотим секвенировать весь ген, для этого используется ряд различных стратегий. получить полную последовательность больших фрагментов ДНК. В одной из часто используемых стратегий реакции секвенирования дидезоксинуклеотидов проводят для определения идентичности и порядка первых 500 или около того нуклеотидов ДНК.
Расширение последовательности путем обхода праймеров
На основе этого анализа химически синтезируется второй праймер, который предназначен для гибридизации с областью примерно на 20 нуклеотидов выше конца полученной последовательности, а затем используется для определения последовательности следующих 500 нуклеотидов. Аналогичным образом выбирается третий сайт связывания праймера, синтезируется другой олигонуклеотид и определяется последовательность следующих 500 оснований. Эта стратегия обхода праймера продолжается до тех пор, пока вся клонированная ДНК не будет секвенирована. Чтобы гарантировать правильность общей последовательности и отсутствие двусмысленности в отношении идентичности любого нуклеотида , необходимо секвенировать обе нити ДНК. Различные начальные праймеры позволяют секвенировать обе цепи; один праймер связывается с цепью на одном конце вставки, а другой праймер связывается с противоположной цепью на другом конце вставки.
Ложное праймирование синтеза ДНК может давать ошибочные и неоднозначные результаты. Такая ситуация может возникнуть, если праймер связывается более чем с одним участком целевой ДНК. Чтобы избежать этой проблемы, праймеры, используемые для этой процедуры, обычно имеют длину не менее 24 нуклеотидов.